Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台研发的用于CUT&Tag实验的文库构建试剂盒，适用于100-1,000,000个细胞起始量的样本建库。CUT&Tag是研究蛋白与DNA互作的技术，相较于传统的ChIP-seq、CUT&RUN，该技术具有文库构建时长更短（仅需7小时）、操作更简单、对起始样本要求更低、抗体投入量更少、文库产量更高等优点。经过细胞捕获、一抗孵育、二抗孵育、转座酶孵育、转座酶激活、掺入DNA标准品、细胞裂解、磁珠回收gDNA、文库扩增和磁珠分选等步骤，靶蛋白结合的DNA片段最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。
本试剂盒包含两个独立模块：BOX-I和BOX-II。BOX-I的核心为结合细胞的ConA磁珠和回收DNA的磁珠，BOX-II包含细胞透化剂、蛋白酶抑制剂、抗体结合buffer、转座酶结合buffer、蛋白酶K以及后续文库扩增所需的所有试剂。此外，本试剂盒已在不同种类细胞（如293T、K562、CHO、ESC细胞等）中进行了验证，均具有良好的建库效率和建库产量。本试剂盒提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库的稳定性和重复性。
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® CUT&Tag试剂盒（pA/G-Tn5版） |
12598ES04 |
4 T |
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12598ES12 |
12 T |
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12598ES48 |
48 T |
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组分编号 |
组分名称 |
12598ES04 |
12598ES12 |
12598ES48 |
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BOX-I |
12598-A |
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ConA Beads |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12598-B |
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DNA Selection Beads |
400 μL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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12598-C |
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Cell wash buffer |
3.6 mL |
10.8 mL |
43.2 mL |
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12598-D |
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ConA bind buffer |
400 μL |
1.2 mL |
4.8 mL |
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BOX-II |
12598-E |
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Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) |
40 μL |
120 μL |
480 μL |
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12598-F |
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5% Digitonin |
15 μL |
45 μL |
180 μL |
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12598-G |
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3 M NaCl |
80 μL |
240 μL |
960 μL |
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12598-H |
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50x Protein blocker |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-I |
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pA/G-Transposome Mix |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-J |
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30x Activating buffer |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-K |
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15x Terminate Solution |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-L |
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DNA Spike-in mix (5 pg/uL) |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-M |
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30x Proteinase K |
4 μL |
12 μL |
48 μL |
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12598-N |
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Primer Mix |
12 μL |
36 μL |
144 μL |
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12598-O |
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2×Ultima Amplification Mix |
100 μL |
300 μL |
1.2 mL |
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12598-P |
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N5(N501) * |
4 μL |
NA |
NA |
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12598-Q |
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N7(N701) * |
4 μL |
NA |
NA |
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【注】：*测序时 Index 序列 N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA。
BOX-I：2-8℃保存，BOX-II：-25~-15℃保存，有效期1年。
一、实验前准备
自备材料
1. 抗体：靶蛋白的一抗和相对应的二抗。
2. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品、文库定量试剂。
3. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
4. Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®（Cat#12416ES）或其他替代引物。
细胞准备
1. 在室温条件下收集细胞并计数，死亡的细胞染色质松散，暴露出大量的裸DNA，转座酶复合物随机切割会造成比较强的噪音信号，建议样本细胞活性不低于80% (细胞活性可以用台盼蓝染色来鉴定)。
2. 贴壁较紧的细胞如Hela细胞等可用Accutase或者Trypsin部分消化获得。
3. 植物或真菌细胞可通过特殊处理获得原生质体或细胞核进行实验，方法可参考附录四。
4. 新鲜或者冻存的动物组织可通过特殊处理获得细胞悬液进行实验，方法可参考附录四和附录五。
二、实验流程
一、组蛋白修饰H3K27me3和H3K4me3 的DNA结合图谱建库
分别使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Histone H3K4me3 antibody (pAb)（Active Motif Cat# B_2615077）和Normal Rabbit IgG（Cell Signaling Technology Cat#2729）作为一抗、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961），使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®对100-1,000,000个293T细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，再使用0.6×和0.4×磁珠分选，文库大小结果使用Qsep和2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
图2 Qsep和琼脂糖凝胶电泳进行文库质量分析
二、不同细胞投入量的H3K27me3的 DNA结合图谱建库测序
使用Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb作为一抗（Cell Signaling Technology Cat#9733）、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961），使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®对100-1,000,000个293T细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K27me3 ChIP-seq数据进行比较。
图3 Qsep对不同细胞投入量文库质量分析
图4 利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K27me3在染色质上的信号分布和相关性
三、不同细胞投入量的H3K4me3 的DNA结合图谱建库测序
使用Histone H3K4me3 antibody (pAb)作为一抗（Active Motif Cat# B_2615077）、Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody作为二抗（antibodies-online Cat#ABIN101961），使用Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina®对100-1,000,000个293T细胞投入量样本建库，并分别使用1.2×磁珠进行纯化，结果使用Qsep进行检测。文库测序后与ENCODE中的H3K4me3 ChIP-seq数据进行比较。
图5 Qsep对不同细胞投入量文库质量分析
图6 利用本试剂盒鉴定不同细胞投入量条件下H3K4me3在染色质上的信号分布和相关性
CUT&Tag实验中使用的一抗，建议使用ChIP级别或者CUT&Tag、CUT&RUN实验验证过的抗体，若无法达到抗体要求级别，可以使用IF级别抗体进行实验尝试。
CUT&Tag实验中使用的二抗，建议根据一抗种属以及Protein A/G的亲和能力选择无任何标记或修饰（HRP、FITC等）的二抗，二抗种属来源以及与Protein A/G的亲和能力进行选择，可以参照以下表格：
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物种 |
抗体亚型 |
Protein A |
Protein A/G(Cat#12598) |
|
Human |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
IgG1 |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgG2 |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgG3 |
++ |
+++++ |
|
|
IgG4 |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgM |
++ |
++ |
|
|
IgA1 |
++ |
++ |
|
|
IgA2 |
++ |
++ |
|
|
Mouse |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
IgM |
- |
- |
|
|
IgG1 |
++ |
++++ |
|
|
IgG2a |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgG2b |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgG3 |
+++++ |
+++++ |
|
|
Rat |
Total IgG |
++ |
++++ |
|
IgG1 |
+ |
+++ |
|
|
IgG2a |
- |
+++++ |
|
|
IgG2b |
- |
+++ |
|
|
IgG2c |
+++++ |
+++++ |
|
|
IgG3 |
++ |
++++ |
|
|
Rabbit |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
Goat |
Total IgG |
++ |
+++++ |
|
Sheep |
Total IgG |
++ |
+++++ |
|
Guinea pig |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
Hamster |
Total IgG |
++ |
+++ |
|
Donkey |
Total IgG |
+++ |
+++++ |
|
Pig |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
Dog |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
Cat |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
|
Cow |
Total IgG |
++ |
+++++ |
|
Horse |
Total IgG |
++ |
+++++ |
|
Monkey |
Total IgG |
+++++ |
+++++ |
【注】：+++++代表亲和能力非常强，+++代表亲和能力中等，+代表亲合能力很弱，-代表没有亲合能力。
二抗推荐：Guinea Pig anti-Rabbit IgG (Heavy & Light Chain) antibody（antibodies-online Cat#ABIN101961）
驴抗兔IgG H&L （Abcam #ab6701）
山羊抗兔IgG H&L（Abcam #ab6702）
Rabbit anti-Mouse IgG (Heavy & Light Chain) Antibody（antibodies-online Cat#ABIN101785）
山羊抗小鼠IgG H&L（Abcam #ab6708）
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